本文聚焦于一项使用CSD-Discovery软件包的研究，该研究旨在确定治疗糖尿病引起的并发症的药物结构模型，并揭示了未来药物设计的关键分子特征。这一案例展示了全球科学家在剑桥晶体学数据中心（CCDC）的支持下，如何利用这一工具包进行创新研究。

概括

在此研究中，东邦大学和Kowa公司的研究团队运用CSD-Discovery软件包，评估了合成的绿色荧光蛋白（GFP）模型化合物及其衍生物在醛糖还原酶（ALR2）抑制方面的潜力。这些抑制剂有望用于治疗糖尿病相关并发症。研究通过IC50值测试，确认了这些GFP模型化合物的显著生物活性，其中某些化合物的活性甚至超过了已知的高效醛糖还原酶抑制剂Sorbinil。

研究过程中，团队采用GOLD分子对接软件模拟这些潜在抑制剂与目标蛋白的相互作用，并使用SuperStar软件来预测对接构象和识别对高抑制活性至关重要的分子特征。

研究背景

醛糖还原酶是一种依赖NADPH的酶，它利用NADPH作为多元醇通路中的还原剂，催化D-葡萄糖还原为D-山梨糖醇。大多数葡萄糖通过糖酵解系统中的三羧酸（TCA）循环进行代谢。然而，在高血糖患者中，葡萄糖会主动流入糖酵解系统和多元醇途径，导致ALR2被激活以消耗过量的葡萄糖，从而在细胞内形成高浓度的D-山梨糖醇。D-山梨糖醇氧化为D-果糖的过程非常缓慢，导致D-山梨糖醇的细胞内浓度升高，消耗大量的NADPH。最终导致渗透压失衡，从而导致糖尿病并发症发生，如周围神经病变、白内障以及肾脏和小血管损伤等。因此，抑制ALR2的活性可能会缓解或预防此类并发症。

当前已有多种ALR2抑制剂（ARI）被报道，并在临床试验中进行了测试，但许多ARI表现出低活性或副作用。ARI药物十分罕见，截至目前只有依帕司他（Epalrestat）在日本获批，用于治疗糖尿病引起的周围神经病变。

研究方法与结果

本研究选用GFP发色团作为模型结构，因其含有与其他ALR2抑制剂相似的N-羧甲基（NCH2CO2H）基团，且与Epalrestat在分子骨架和电子排布上具有相似性。研究团队使用GFP发色团模型合成了一系列咪唑酮类化合物，并评估了它们对体外ALR2的抑制活性，如下表所示。

随后，研究人员使用GOLD分子对接软件，将13个化合物分别对接到7个具有不同PDB编号的GFP蛋白结构中，并分析了不同化合物和受体的相互作用。结果表明，各发色团类似物与4IGS（含酚羟基的配体与ALR2的晶体复合物结构）的对接评分ChemPLP与pIC50具有良好的相关性（r2=0.908），说明通过GOLD软件产生的对接构象是准确可靠的。

使用GOLD确定各发色团类似物与GFP的最佳结合模式

分析各化合物与GFP蛋白对接结果显示，除1i外，其余化合物中的4-亚芳基与Trp219的平行排列形成π-π相互作用。特别是，活性最佳化合物1h的萘基与Trp219的吲哚环间形成了最佳的π-π作用。此外，1h的羧基延伸至蛋白的阴离子结合口袋，并与His110及Tyr48形成氢键。这些发现表明，芳环与Trp219的疏水作用及阴离子结合口袋内的氢键作用，在ALR2配体结合机制中发挥着至关重要的作用。

活性最优化合物1h与GFP的最佳结合模式示意图，图中还包括GFP结合位点残基的疏水相互作用表面。

根据GOLD对接结果阐明各发色团类似物活性差异的原因

进一步分析表明，含酯基化合物6a的活性（IC50=23μM）比相应的含羧基化合物1a（IC50=0.36μM）低约60倍。含酯基化合物6a与4IGS的对接姿态与化合物1c–j显著不同。在6a中，咪唑酮和苯环的取向发生了翻转，酚羟基位于阴离子结合口袋中，与His110形成氢键。（下图a）。

化合物2（IC50=10.7μM）显示了类似的“翻转”姿势，尽管含有羧基，其抑制活性仍较低。根据GOLD对接结果显示（下图b），化合物2中的阴离子羧基未与4IGS的催化口袋结合，而是与Ser302的主链NH形成氢键；其苯酚部分则插入阴离子结合口袋中，与His110形成氢键；咪唑酮环的C5位羰基与Leu300的主链NH形成氢键，咪唑酮环面向Trp219。这些额外的相互作用可能在一定程度上提高了化合物2的生物活性。至于为什么其活性却低于含羧酸的系列1化合物，这可能是催化口袋的紧密结合丧失造成的。

化合物1m的对接模式也呈现“翻转”状态（下图c），咪唑酮环N1位置的羧基指向蛋白质外部，而苯环上的另一个羧基与Tyr48、His110和Trp111形成紧密的氢键网络，这解释了其较高的活性（IC50=0.31μM）。

对化合物1b（1a的间位类似物）的研究发现，其羧基通过与His110形成氢键伸入催化口袋，间位羟基与Ala299和Leu300的骨架NH形成氢键（下图d）。然而，4IGS中化合物1b的对接预测构象与几何优化后的构象不同。在对接实验中，苯环旋转了近180°。根据分子力学计算，该旋转势垒约为2.0kcal/mol，表明化合物1b需要额外的能量才能以这种特定姿势伸入结合位点，这可能是化合物1b活性低下的原因。

(a)(b)(c)(d)分别为化合物6a、2、1m和1b
对接到4IGS的最佳结合构象。

使用SuperStar发现各发色团类似物的药效团

研究人员还使用SuperStar相互作用热点预测软件，在蛋白-配体晶体结构的结合位点周围生成了相互作用热图。根据SuperStar提供的基于知识的相互作用预测结果，研究者能够将蛋白质活性位点（PDBCode：4IGS）周围的蛋白配体相互作用区域进行可视化分析，从而验证了13个小分子抑制剂的疏水性对ALR2抑制活性的影响。

使用SuperStar软件预测的4IGS结合位点的相互作用倾向图，品红色表示疏水相互作用区域，黄色表示氢键供体区域。将预测的化合物1h结合模式叠合到该图，清楚地表明配体中的羧基和萘环与预测的相互作用倾向区域密切相关。

综合所述，该研究团队借助GOLD和SuperStar软件的强大功能，深入解析了GFP发色团衍生物与ALR2抑制活性之间的详细构效关系。

研究结果揭示，GFP发色团模型中的关键结构特征，特别是N1位置的羧酸基团和4-芳基亚甲基部分的疏水性，对于高效的ALR2抑制至关重要。

这一发现不仅展示了GOLD和SuperStar在蛋白质结构分析和药物设计领域的应用潜力，也为未来糖尿病并发症治疗药物的开发提供了重要的分子基础。

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参考文献
SaitoR,HoshiM,KatoA,IshikawaC,KomatsuT.Greenfluorescentproteinchromophorederivativesasanewclassofaldosereductaseinhibitors.EurJMedChem.2017Jan5;125:965-974.doi:10.1016/j.ejmech.2016.10.016.

任编辑：白芨

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