由于mAb可以通过FcRn循环从溶酶体降解中释放出来，mAb表现出较长的血浆/血清半衰期和较低的体内清除率。然而，用于治疗慢性病或预防某些疾病的单抗需要更长的半衰期，更低的清除率以及更少的剂量频率，以改善其便利性。因此，进一步提高半衰期和降低清除率的抗体工程对各种疾病的患者可能都是有价值的。抗体工程技术对于由于各种原因表现出较短的半衰期或较高清除率的mAb也是十分有用的，例如非特异性结合、靶向介导的药物处置 (TMDD)和靶外结合，它们较短的半衰期或较高的清除率降低了mAb的治疗价值。本文将介绍改善mAb半衰期和清除率的创新抗体工程技术，以提高mAb在临床开发中的潜力。

  等电点(PI)/电荷工程  

通常，mAb可以通过非特异性内吞作用进入细胞，然后转移到内体。非特异性内吞作用的机制不依赖于靶抗原，因此，虽然这种机制有助于清除所有单抗，但其对清除的贡献率因单抗不同而不同。据报道，通过内吞作用摄取大分子的速率受到电荷/PI的影响。研究显示阳离子分子(高等电点/正电荷)通过内吞作用表现出比阴离子分子(低等电点/负电荷)更高的摄取速率。给野生型小鼠静脉注射8株不同等电点的人源化IgG4单抗后进行药代动力学研究，结果显示等电点与清除率呈显著正相关，与半衰期呈显著负相关（图1）。此外，在FcRn功能缺陷的B2M基因敲除小鼠中，用4株具有代表性的单抗也证实了PI与清除率或半衰期的相关性以及PI效应与FcRn无关。

图1. 在普通鼠中不同等电点的人源化IgG4单抗的药代动力学

组织分布研究评估了不同等电点的mAb的清除途径，发现PI较高的mAb在肝和脾这两个高度血管化的器官中的降解率很高。

因此通过抗体优化过程中，降低pI/电荷将是改善mAb药代动力学的一个有价值的途径。例如通过在可变区和恒定区引入突变，可以降低mAb的等电点/电荷。目前已经报道通过降低等电点或平衡电荷分布可以改善mAb对IL-12/23、 HER2、LTA等靶点的药代动力学。这里不再详细表述。然而改变可变区的氨基酸可能会影响其抗原结合亲和力或生物物理性质，而将恒定区的氨基酸改变为非自然序列可能会增加免疫原性的风险。因此，在应用PI/电荷工程改善mAb的药代动力学时应考虑这些因素。

  增强与FcRn的结合的抗体工程技术  

新生儿Fc受体（FcRn）是一种MH1Like异二聚体，在细胞运输和IgG的血清半衰期中发挥核心作用。mAb通常可以通过FcRn循环系统从内体循环回血浆，使mAb在体内表现出较长的半衰期和较低的清除率。虽然FcRn可以将mAb从内体循环到血浆中，但在酸性pH条件下，通过抗体工程来增加FcRn的结合，进一步提高mAb的回收效率。

在过去的十几年中，已经报道了一些突变来增强了FcRn在酸性pH条件下的结合，并提高了从内体到血浆的回收效率（图2）。

图2. Fc 工程增强抗体与FcRn结合

噬菌体展示Fc变体文库的筛选鉴定了在pH 6.0下具有增强与人FcRn结合的突变体YTE（M252Y / S254T / T256E）。研究显示，YTE变体与人和食蟹猴FcRn的结合能力增加了10倍，在食蟹猴PK研究中半衰期增加了4倍。Motavizumab-YTE是一种靶向呼吸道合胞病毒的人源化抗体，是第一种针对FcRn介导的半衰期延长而设计的抗体，已在人类受试者中进行测试。I期临床试验结果显示，相对于Motavizumab IgG1，其半衰期增加2至4倍。而且Motavizumab-YTE和Motavizumab的抗药抗体(ADA)发生率相当，提示YTE突变不会增加人类免疫原性的风险。YTE突变的应用对生物利用度也没有负面影响。YTE突变的缺点之一可能是FcγRIIIA结合减少，导致ADCC活性降低。当ADCC被要求作为一种作用模式时，使用YTE突变应该慎重考虑。此外，−8◦C发现，具有YTE突变的IgG与WT hIgG1相比具有较低的热稳定性，这可能会影响抗体的溶解性和聚集性。

Zalesky等人研究表明M428L/N434S突变(LS)在pH6.0下对人FcRn的亲和力增加11倍。当用含有LS突变的抗VEGF抗体处理人FcRn转基因荷瘤小鼠时, 与IgG1处理的动物相比，观察到更好的抗肿瘤效果。这是FcRn依赖性半衰期增加导致改善的抗肿瘤活性的第一个体内证明。与YTE突变不同，LS突变保留了与WT IgG1抗体相当的FcγRIIIA结合和ADCC活性。因此，当疗效需要ADCC活性时，LS突变比YTE突变更合适。首次用ALXN1210(Raverizumab)研究LS突变对单抗药代动力学的影响。ALXN1210是一种人源化的具有LS突变的抗补体C5IgG2/4单抗，用于阵发性睡眠性血红蛋白尿和非典型溶血性尿毒症综合征。其是eculizumab工程化版本，通过基因工程改造Fc区域，引入的氨基酸替代(VH_Y27H，VH_S57H，M428L，N434S)导致半衰期延长4倍，允许剂量从每2周减少到每8周一次，同时保持疗效。ALXN1210是目前唯一一个通过增加与FcRn的结合改善半衰期而获得FDA批准的治疗性抗体。

另一个提高抗体半衰期的机制是通过Fc工程设计抗体变体，在胞外pH条件下与FcRn不结合，在胞内pH增强FcRn的结合。pH为7.4时IgG的残留结合已被证明对血浆循环和循环持久性有负面影响。这一过程对于需要释放到血浆中并在那里持续存在的抗体是有利的，例如，针对细胞结合靶标的抗体。Lee等人合理设计大肠杆菌高通量筛选文库，以鉴定在pH 5.8而不在pH 7.4时选择性与FcRn结合的hIgG1 Fc突变。通过这些筛选策略，他们发现突变体L309D/Q311H/N434S（DHS）在胞内pH与FcRn结合的能力是WT hIgG1的5倍，而在细胞外pH下不结合。在体内， hIgG1-DHS在hFcRn/hβ2M/hFCγR的小鼠中的半衰期是WT hIgG1的4倍以上。与YTE突变不同，DHS突变的抗体同样保持了FcγR结合的能力以及ADCC活性。

另外也可以设计突变来调节细胞外pH的结合。识别在细胞外pH下与FcRn有不同结合的抗体变体的一个基本理念是产生所谓的“sweeping 抗体”来清除可溶性靶标。因为使用常规抗体靶向可溶性抗原的一个不良后果是，它可能会导致抗原量增加。这是由于IgG的半衰期比结合的抗原的半衰期要长得多，从而使得抗体-抗原复合物的积累，由于清除率的减少而增加了血浆抗原的存在。为了改善这一点，通过设计sweeping 抗体，以增强与FcRn在胞内和胞外pH的结合。在pH 7.4时，增加与FcRn的结合可以阻止抗体释放到血浆中，使其与可溶性抗原形成复合物，抗体-抗原复合物然后可以迅速内化到细胞内。sweeping 抗体通常被设计成一旦内化在内体中就能与抗原解离，从而溶酶体只针对性的降解抗原（图3）。

图3.sweeping 抗体作用机制示意图

研究发现突变体M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(简称YTE-KF)与FcRn的结合在胞内和胞外pH时均增加了20倍。另一个能增强与FcRn结合的hIgG1突变的例子是M252Y/V308P/N343Y突变。与WT-hIgG1相比，在胞外pH条件下与FcRn的结合>2500倍，在内体与FcRn的结合增加了>400倍。在体内，与WT hIgG1抗体相比，携带M252Y/V308P/N343Y突变的IL-6R抗体在处理hFcRn转基因小鼠后，血浆中的人可溶性IL-6R总量降低了1000倍。

如上所述，改善半衰期的FC工程将赋予mAb更长的生物利用度和潜在的治疗效果，同时降低了给药频率。

  pH依赖性解离靶抗原的抗体工程技术  

据报道，一些单抗在动物和人身上都表现出TMDD。TMDD常见于靶抗原位于细胞表面(膜结合的靶抗原)，如IL-6受体、EGFR、CD40、CD81、OX40(CD134)等。TMDD消除快，半衰期短，导致血浆/血清抗体浓度低。因此，当TMDD发生时，需要更频繁或更高的剂量来维持血浆/血清中抗体的有效浓度。

为了克服在靶向膜结合的靶抗原时这种快速消除的问题，发明了能够依赖pH与靶抗原结合的mAb。在这个概念中，mAb首先与膜结合的靶抗原结合，然后与靶抗原一起内化到内体中。然后，在酸性内体(pH 6.0左右)中，mAb与靶抗原解离。虽然靶抗原随后会被转移到溶酶体并降解，但解离的mAb与酸性内体中的FcRn结合，并被循环回到质膜，从FcRn释放到血浆中。这种方法已经被证明是有效的，可以最大限度地减少TMDD介导的快速消除。

例如通过在常规人源化IL-6受体IgG1抗体中引入几个组氨酸突变和其他一些突变，产生了一种新型的具有pH依赖性结合特性的人源化IL-6受体IgG1抗体(称为循环抗体)。酸性条件下的组氨酸质子化改变了mAb的结构，改变了mAb与靶抗原的静电相互作用。人源化的无pH依赖性结合的IL-6受体IgG1抗体tocilizumab，在pH 7.4和6.0, 其KD与人可溶性IL-6R仅相差2倍，而pH依赖性结合的变异体(PH2)的KD则相差22倍。在食蟹猴中，与tocilizumab、tocilizumab-FcRn(tocilizumab带有N434A突变的tocilizumab)和亲和力成熟的tocilizumab-FcRn(与N434A突变的tocilizumab高亲和力tocilizumab-FcRn)相比，PH2-FcRn(PH2在Fc中有N434A突变，以增加FcRn在酸性pH下的结合并改善清除率)显著改善了静脉和皮下注射后的清除率。尽管单独增加FcRn结合并没有改善药代动力学，但pH依赖结合和增加FcRn结合的组合确实显著改善了tocilizumab的药代动力学(图4)。比较Tocilizumab和PH2-FcRn的IL-6受体中和时间，PH2-FcRn 2 mg/kg可抑制C反应蛋白(CRP)至少4周，而Tocilizumab 2 mg/kg仅抑制CRP 1周。

图4. pH依赖性抗IL-6受体抗体在食蟹猴中的药代动力学

Chaparro-Riggers等人报道了一种pH依赖性的抗PCSK9抗体的产生。传统的抗PCSK9抗体在食蟹猴和恒河猴中的半衰期十分短(分别为2.5天和3.2天)。虽然PCSK9是一种可溶性蛋白，但PCSK9结合会影响PCSK9抗体的药代动力学。野生型和PCSK9基因敲除小鼠的药代动力学数据表明，PCSK9介导了一种常规PCSK9抗体的TMDD。因此，为了最小化PCSK9介导的TMDD，通过对常规人源化抗PCSK9 IgG2抗体J16进行组氨酸扫描，产生了一种pH依赖的抗PCSK9抗体。研究表明常规抗PCSK9小鼠IgG1抗体J10在野生型小鼠中的半衰期较短(2.9天)，而pH依赖的抗PCSK9小鼠IgG1抗体J17的半衰期达到14.4天。在FcRn基因敲除小鼠中，pH依赖的PCSK9结合对PCSK9介导的TMDD的改善作用减弱，这表明pH依赖性的PCSK9抗体在酸性内体中从PCSK9中解离出来，并以pH依赖的方式与FcRn结合后，从内体循环到细胞膜。这些数据表明，pH依赖的PCSK9结合显著改善了PCSK9介导的TMDD，从而增强了PCSK9抗体的药代动力学。

以上所述，pH依赖的靶抗原结合对TMDD的影响已经得到了验证，包括膜结合的靶抗原和可溶性的靶抗原。当在临床前研究中观察到TMDD，可以应用pH依赖的靶抗原结合工程来最小化TMDD。

  小编总结  

本文介绍了三大可以改善抗体药代动力学特性的抗体工程技术。有三个主要过程决定了mAb的药代动力学，可以通过抗体工程技术来调节这些过程。第一个主要过程是非特异性内吞作用，可通过PI/电荷工程进行调节。第二个过程是FcRn介导的从内体到血浆的循环，这可以通过在酸性pH下增加FcRn结合来调节。第三个过程是TMDD，这可以通过与靶抗原的pH依赖性结合来调节。目前基于这些抗体工程技术的治疗性抗体已经显示出在动物和人类中药代动力学的改善。相信随着后续的研究深入以及临床进展，它会为患者提供益处，如皮下注射和更长的给药间隔以及通过减少剂量减轻经济负担。

参考文献

1.Improvement of pharmacokinetic properties of therapeutic antibodies by antibody engineering.

2.Fc-Engineering for Modulated Effector Functions-Improving Antibodies for Cancer T reatment.

3.Sweeping antibody as a novel therapeutic antibody modality capable of eliminating soluble antigens from circulation.

4.Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region.

责任编辑：琉璃

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