基因疗法和基因治疗药物

基因疗法 （gene therapy） 的设想早在1972年就已出现，当时的设想是通过基于DNA的药物，将健康的基因插入细胞中以替代致病基因变体，随着基因治疗药物的发展，基因治疗药物在心血管、癌症、病毒感染、遗传性疾病等等领域均有着极大的发展。以基因的承载的载体可分为细胞治疗药物，基因治疗药物和核酸治疗药物。狭义的基因疗法指的是以将带有遗传物质的载体直接注射到人体内，载体的类型可分为病毒载体（主要包括慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、简单疱疹病毒等），非病毒载体（主要包括裸露DNA、脂质体、纳米载体等）。目前上市的基因治疗药物中主要以病毒载体作为传递介质，如下表，部分上市药物的信息如下：

基因治疗药物载体和递送

在实践过程中，基因治疗药物的载体为重组的病毒载体。该重组载体由天然病毒载体的衣壳蛋白和结构蛋白组成，该载体的衣壳内缺乏病毒的功能蛋白基因序列，由含有治疗性的基因序列进行了替换。如下图目前主流的病毒载体包括慢病毒载体，逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体和简单疱疹病毒载体等。

在基因治疗药物的递送过程中，越来越多的临床数据表明病人的免疫学因素会显著基因治疗药物的递送效率，进而影响到基因治疗药物的效果。究其原因在于目前大部分的病毒载体如腺病毒，腺相关病毒和简单疱疹病毒等长期能够和人共存，均较好的安全性的同时，也使得人群中均有较大的比例存在抗病毒载体的抗体。人体内的抗病毒载体抗体会极大的影响基因治疗药物的递送效率，进而影响到疗效，对此不同载体的基因治疗药物采用了不同的递送策略。GENDICINE，Imlygic等溶瘤病毒均采用瘤内注射，其中一个重要的原因是腺病毒，单纯疱疹病毒在人群中均有着高滴度的抗体存在。在所有的病毒载体中，腺相关病毒在人群中存在抗载体抗体的比例相对较小，且滴度较低,上市的三个药物Glybera，Luxturna和Zolgensma均采用的静脉注射。

腺相关病毒的抗药抗体和中和抗体检测

大部分人群中预先存在腺相关病毒的抗药抗体和中和抗体，以腺相关病毒为载体，采用静脉注射的基因治疗药物在临床病人入组时预先需要进行抗药抗体的筛选排除以保证疗效。查阅Luxturna和Zolgensma的临床登记资料，NCT00516477和NCT03381729，在病人的入组排除标准中，NCT00516477有Subjects will be excluded if immunological studies show presence of neutralizing antibodies to AAV2 above 1:1000,  NCT03381729有 Anti-AAV9 antibody titers >1:50 as determined by Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) binding immunoassay，根据描述，在病人入组的排除标准中中和抗体或者抗药抗体的检测是必不可少的。

人血清腺相关病毒的中和抗体检测方法

人血清腺相关病毒的中和抗体检测方法的检测原理是构建一个和基因治疗药物有相同衣壳蛋白的腺相关病毒AAV-CMV-Luc，该病毒能够自主表达萤火虫素酶。使用AAV-CMV-Luc感染细胞，通过使用Bright-Lumi底物和萤火虫素酶反应，通过检测化学发光评判感染的效果。在AAV-CMV-Luc感染细胞之前，会和梯度稀释的血清进行预先孵育，血清中的抗AAV中和抗体能够阻断AAV-CMV-Luc感染细胞，导致荧光信号的衰减，从而评价血清中抗AAV中和抗体的效果。

从原理到实际的方法开发过程中，有非常多的变量因素需要考虑，如果该方法用于临床病人的筛选需要经过严格验证，如何保持方法在长期的检测中保持信号和数据的稳定也将会是一个挑战，熙宁生物有自主知识产权的经过严格验证的抗AAV8中和抗体检测方法，部分难点和技术参数如下：

难点：在人血清基质环境中和无血清基质环境中，AAV-CMV-Luc的信号差异极大。实验结果表明，腺相关病毒载体可以利用血清中的某些成分增加其转染效率。血清中影响腺相关病毒转染效率的关键因素有两个：中和抗体浓度和血清成分

解决方案：在反应体系中加入阴性血清，用于人血清样品和腺相关病毒的稀释，使信号均一化，从而排除血清成分的影响。

技术参数1：个体血清基质经1：10稀释后，中和AAV8腺相关病毒的能力

测试44个人血清样品，实验结果表明个体血清基质中中和抗体呈两极分化的趋势。

技术参数2：方法灵敏度

实验结果表明，以阴性对照信号的一半S/N=0.5作为筛选阈值，方法的灵敏度可达5.2 ng/mL。

熙宁生物的基因治疗临床检测服务平台

熙宁生物已经搭建了较为齐备的基因治疗临床检测的服务平台，从病毒载体的中和抗体检测，血清和组织中细胞因子检测，病毒拷贝数检测，免疫细胞分型检测等检测技术服务能力，欢迎咨询......

责任编辑：白芨