配体结合分析实验（Ligand Binding Assay，以下简称LBA）广泛应用于大分子生物药物领域，在药代动力学分析、免疫原性和生物标志物分析中占据重要的地位，贯穿了生物药临床前到临床上市监测的整个过程。关键试剂是整个LBA方法的基石，在实际的检测分析中，往往会遇到批次更换的情况。本文将主要从关键试剂批次变化对方法性能产生的影响及对产生的影响如何进行评估进行阐述。

关键试剂（critical reagent），从字面意思理解，是指分析过程中对方法的性能及参数表现至关重要的试剂。监管机构和一些文献也提出将某些试剂确定为关键试剂，关键试剂一般包括结合蛋白，配子（寡核苷酸，多肽链），抗体或标记物等。生物分析业界沿用并扩大这一定义，包括多肽，如受体或配体，及它们的片段; 酶偶联物; 和在某些情况下的生物基质。

关键试剂管理涉及试剂采购、储存、变更和稳定性等各个方面，而关键试剂是LBA方法性能稳定表现的基础，当其发生变化时可能会改变方法的性能，从而影响分析结果。法规和各大指导原则也对关键试剂都提出了一些要求，在获得关键试剂时，其质量需有合适的表征和记录，文件至少包含但不限于名称、批号、来源、纯度、浓度（如有）或滴度、亲和力、分子量、储存条件和有效期等。关键试剂发生改变时，须通过生物分析评估，确认方法性能不变，保证测定结果与原关键试剂的一致性。

在LBA方法中，通常不可避免会引入新批号的关键试剂，例如原始批号的关键试剂使用完、试剂厂家倒闭或者不再生产该试剂等。避免这种情况最有效的方式是提前备足货，保证完成整个试验阶段。然而，现实中更常见的是，会出现一些可预见或者不可预见的情况使我们不得不在项目进行中更换试剂批号或来源。这时，对关键试剂的变更评估是非常有必要的。我们需要预先在SOP或者项目方法方案中建立其评估方法和接受标准，科学的对关键试剂进行变更评估。下面是评估关键试剂的两个层面，包括微小变更（minor change）和重大变更（major change）。

微小变更
试剂的微小变更是对方法性能影响极小的改变，不会对数据生成产生影响。这些微小变更如试剂批次变更，新批次和原批次的源头是一样的（如：来自同一原液或者细胞系）；新旧批次的制备流程也是一样的（如：从相同动物中提取的多克隆血清进行新的一次亲和纯化，或者使用相同的偶联流程对相同批次的蛋白进行一次新的偶联）。

第一个层面包含关键试剂中共有的测试（图1）。单个关键试剂批号的变更，对于PK和biomarker分析，建议进行一个准确度和精密度实验，最好包括定量下限和定量上限在内的5个浓度水平的质控样品；对于ADA分析，应包括接近阴性质控，高浓度和低浓度阳性对照样品的3个浓度水平的质控样品。如果多个试剂批号的变更，可以使用同一方法在同一个实验中进行资质确认。在这种情况下，建议进行至少2个测试，以提高测试结果的可信度。在可能的情况下，对新批次和原始批次的关键试剂做平行测试，对监控分析方法性能的变化趋势非常有用。当然这种平行实验不一定是必需的，也可以通过趋势分析来考察，但不建议作为评估实验的接受标准。在测试结果不符合接受标准的情况下，可以通过重新配制标准样品和质控样品进行一次新的测试；如果重新测试的结果满足接受标准通常可认为评估完成，建议是再进行一次测试，以增加测试结果的可信度。如果重新测试的结果不满足接受标准，可能存在两种可能性：一是制备新批次的试剂不可用；二是试剂的本身出现了变化，需要重新优化方法，这种情况将视为重大变更的层面了。在没有原始批次的关键试剂的情况下（图2），对质控的监控就变得更加关键了。当新批次关键试剂的测试实验产生了可接受的数据，其结果也可作为能够接受试剂更换的记录。

重大变更
试剂的重大变更是对方法性能影响极大的改变，最常见的是不能获得原始厂家的试剂，需要更换其他厂家的同类试剂的情况；还包括从新动物获得的新的血清，使用新的克隆株生产新的抗体，或使用新的细胞系表达重组蛋白等。另外还需要关注一种情况，当ADA分析中更换新批次的阴性质控，也可能对分析方法的性能产生重大影响。对关键试剂的重大变更也应采取以下步骤（图1）：至少进行3个分析批测试，每一个分析批需平行测试新试剂和原始试剂。如果新试剂测试结果不满足接受标准，我们需评估测试结果失败的原因，例如试剂结合能力或者亲和力的差异导致原标准曲线的定量范围不合适了；试剂与分析体系中的非特异性结合增加，使本底信号增加等等。在适用于研究目的的前提下，新的试剂还是可以使用的，但需对分析方法进行优化和部分验证。在没有原始批次的关键试剂的情况下（图2），新批次的关键试剂需要进行部分验证，若新批次关键试剂的测试实验产生了可接受的数据，其结果也可作为能够接受试剂更换的记录。对于PK和biomarker分析，部分验证包括至少3个精密度和准确实验，选择性等；对于ADA分析，部分验证包括至少临界值确认，精密度，选择性和耐药性等。

支持新药开发的生物分析方法可能跨越几年，甚至十几年，因此，我们需要在分析方法和项目生命周期管理的背景下，考虑关键试剂的管理。本文根据现有监管机构指南、相关白皮书，对关键试剂批号变更的做法及评估进行了一个简单的总结，为项目中关键试剂变更的问题提供参考。

参考文献
1.King, L, et al., Ligandbinding assay critical reagents and their stability: recommendations and bestpractices from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. The AAPSjournal, 2014. 16(3): p. 504-15.2.  DeSilva B, et al.
2.EBF recommendation on practical management of critical reagents for antidrug antibody ligand-binding assays. Bioanalysis. doi:10.4155/bio-2019-0248

 图片来自Lindsay E. King, et al. The AAPS Journal, Vol.16, No.3, May 2014.

图片来自Susnne Pihl, et al. Bioanalysis, White Paper, doi:10.4155/bio-2019-0248
.

责任编辑：白芨