基于探针的LAMP检测中设计了不同的探针，包括修改其中一个核心LAMP引物和/或在反应中引入额外的探针或添加剂。

基于探针的LAMP检测的演变
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1、基于同化探针的LAMP检测

同化探针由两个部分互补的寡核苷酸组成：荧光探针和淬灭探针。荧光探针是通过在环引物（LF或LB）的5'端添加荧光团（用F表示，红色）标记的通用寡核苷酸(F链)设计的。淬灭探针（Q链）与荧光探针的F链互补，并在其3'端标记有淬灭剂（用Q表示，蓝色）。在没有目标DNA的情况下，荧光被淬灭，因为荧光探针和淬灭探针的杂交将淬灭剂和荧光团带到一起（图1A）。在目标DNA存在的情况下，启动LAMP。沿着由荧光探针启动的DNA链，新合成的DNA链取代淬灭探针以释放荧光团的荧光信号（图1B）。

图1:基于同化探针的LAMP测定的原理
F:荧光团；Q:淬火剂PMID:37174922

2、使用淬灭释放(DARQ)检测扩增

DARQ于2012年由Tanner首次提出。该探针的设计是通过在FIP的5'端标记一个猝灭剂，并添加一个额外的3'荧光团标记的探针，该探针与FIP的F1c互补（图2A）。在没有目标DNA的情况下，双链线性DNA探针不会产生荧光信号。在LAMP扩增过程中，新合成的DNA链取代3'荧光团标记的探针释放荧光信号（图2B）。

图2:DARQ检测扩增的原理
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3、基于淬灭探针(Q探针)的LAMP检测

2018年，Shiratoa等人开发了一种使用猝灭探针（Q探针）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）测定法。靶向LAMP扩增子环区的Q探针是通过将一个环引物的3′端延长10_15nt而简单设计的，并以3′荧光团（例如BODIPY）标记的胞嘧啶为特征（图3A）。当Q探针与靶序列杂交时，荧光被靶序列中存在的鸟嘌呤残基猝灭（图3B）。

2019年，Takayama等人通过直接标记其中一个环引物的5′胞嘧啶处的荧光团，进一步简化了Q探针的设计。与上述双链线性DNA探针不同，Q探针的荧光信号在不存在靶DNA的情况下释放，并且当Q探针与靶杂交时荧光猝灭。结果，荧光信号减少，伴随着LAMP扩增过程中扩增子的积累。LAMP扩增子可以使用实时荧光PCR仪器进行实时监测，指数扩增产生具有连续猝灭荧光信号的倒S曲线。

图3:基于淬灭探针(Q探针)的LAMP检测的原理
C:胞嘧啶PMID:37174922

4、酶介导的基于探针的LAMP检测

酶介导的基于探针的LAMP检测利用额外的酶（例如核酸内切酶、高保真DNA聚合酶）或Bst5.0/5.1DNA聚合酶来识别和切割探针以释放荧光信号。

4.1多重内切酶酶切实时环介导等温扩增（MERT-LAMP）

Wang等人于2015年开发了MERT-LAMP。在MERT-LAMP中，通过将额外的寡核苷酸连接到内部引物（例如FIP）的5′端来设计探针，并且寡核苷酸携带5′荧光团和3′猝灭剂，这两个荧光团和猝灭剂都通过限制性内切核酸酶识别位点分离（图4A）。在初始扩增阶段，具有核酸内切酶识别位点的正向内部引物FIP与F2c区域结合，以促进DNA的合成。通过使用外部引物F3引发的上游DNA合成来置换新合成的链。对B2c序列的BIP退火合成寡核苷酸探针的互补序列。当产生含有核酸内切酶识别位点的双链DNA时，Nb.BsrDI识别限制性核酸内切酶位点并消化双链DNA。这个过程分离荧光团和猝灭剂，产生荧光信号（图4B）。伴随着LAMP的指数放大，荧光信号不断产生。

图4:MERT-LAMP的原理
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4.2Tth核酸内切酶裂解环介导的等温扩增（TEC-LAMP）

Higgins等人于2018年开发了TEC-LAMP。代替核酸内切酶识别位点，使用可以用Tth核酸内切酶IV切割的碱基位点来连接荧光团和猝灭剂，上上述原理相似。

4.3高保真DNA聚合酶介导的LAMP

基于LAMP的检测主要依赖于非特异性分析方法，例如DNA嵌入染料、金属离子指示剂、反应浊度和标记引物；也就是说，非特异性分析方法无法识别非特异性扩增子，这在某些情况下会出现问题，尤其是在检测基因序列具有高度同源性的样本的情况下。此外，由于LAMP难以在一锅（one-pot）中进行多重检测，许多基于LAMP的方法缺乏内部控制来确保样本收集过程并避免假阳性。同时，基于酶促裂解的探针在特异性分子诊断中非常流行。

2021年后，人们开发了三种原理相似的高保真DNA聚合酶介导的实时LAMP方法。释放的荧光信号被称为"proofreading"酶介导的探针裂解（Proofman探针）、高保真DNA聚合酶介导的探针（HFman探针）和外切酶去除核苷酸错配导致的ANticipatedTarget的发光（LANTERN）。在这些检测中，通过在3′端和5′端，或5′端和3′端分别标记荧光体和淬灭体，选择带有或不带有3′错配碱基的环形引物之一作为探针（图5A）。为了进行实时监测，少量的高保真DNA聚合酶被引入LAMP系统中。在LAMP扩增过程中，探针特异性地与哑铃结构的环状区域结合，然后高保真DNA聚合酶识别并切割标记有荧光体的3′匹配和/或不匹配的碱基，释放出荧光信号（图5B）。

图5:高保真DNA聚合酶介导LAMP的原理
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4.4LAMP结合TaqMan探针和新一代BstDNA聚合酶（Taqman-LAMP）

2021年，Liang等人报道了TaqMan-LAMP的开发，该LAMP使用了创新的Bst5.0/5.1DNA聚合酶（图6A）。Bst5.0/5.1DNA聚合酶具有DNA合成活性和更强的链置换能力，并具有5′-3′核酸外切酶活性。选择位于F1和F2之间的序列作为设计TaqMan探针的靶标，该探针在其5′端和3′端分别用荧光团和猝灭剂标记。将内部引物FIP退火至F2c以促进DNA合成。当Taqman探针特异性结合靶标时，Bst5.0/5.1DNA聚合酶可以切割Taqman探针以释放荧光信号（图6B）。在指数扩增阶段，TaqMan探针的持续结合和切割导致荧光信号的连续产生。

图6:Taqman-LAMP的原理
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对新发和再发传染病特异性准确POCT检测的迫切需求推动了各种基于探针的LAMP方法的发展。

各种基于探针的LAMP检测在病原体检测中的应用总结如下表

近二十年来，LAMP以其灵敏度高、速度快、检测简便等优点越来越受到人们的关注，用于动植物病毒、细菌、真菌、支原体、寄生虫等病原体的POCT检测。

各种基于探针的LAMP方法的发展，不仅解决了非特异性检测和低准确性的问题，而且提高了扩增速度和检测灵敏度，实现了一锅多重检测。

鉴于基于探针的LAMP相对于传统LAMP方法的优势，以及与qPCR在特异性、灵敏度、多重检测能力可比性和更快的反应速度，基于探针的LAMP展现出很高的商业和临床应用潜力，特别是在检测新发和再发传染病方面。

参考文献
1.DingS,etal.BiosensBioelectron.2021Apr15;178:113041.
2.ZhangX,etal.Diagnostics(Basel).2023Apr24;13(9):1530.
3.AugustineR,Biology(Basel).2020Jul22;9(8):182.

LAMP引物设计软件：LAMPDesigner

LAMPDesigner可以为环介导等温扩增分析设计高效引物，在等温条件下扩增DNA和RNA序列，无需进行PCR温度设置。该技术依赖于自动循环和DNA聚合酶介导的链置换DNA合成，可在不到一小时内将DNA拷贝扩增至109数量级。逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）可以用来扩增RNA序列。

Designer设计LAMP引物优势：避免交叉同源性，BLAST验证引物的特异性；多重LAMP引物集合，可以进行检查是否试用于多重PCR实验；多种格式结果导出；数据和数据库管理，可以创建多个实验项目，多个实验数据可以通过为每一个实验创建单独的项目来进行管理。

责任编辑：白芨

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