2016 年2 月，国务院办公厅正式印发了《关于推进仿制药质量和疗效一致性评价的意见》，对企业开展仿制药疗效一致性评价的工作做出了部署，明确要求2018年底之前完成2007 年10 月1 日新的药品注册办法实施前批准的，国家基本药物目录中化学药品仿制药口服固体制剂的一致性评价。届时，没有通过评价的，注销药品批准文号。对其他已批准上市的药品，自首家品种通过一致性评价后，其他生产企业的相同品种在3年内仍未通过评价的，注销药品批准文号。该文件明确要求制药企业需对原研制剂进行更精确的透彻解析，也就是通常所说的“逆向工程”，以达到与原研的“一致性”。

在欧美大型药企，从事逆向工程的部门是一个重要部门，而且所涉及的分析方法也比较多。本文将重点介绍其中比较新型的光谱技术之一————拉曼光谱。拉曼效应的产生是来源于单色辐射光源与具有高度可极化的官能团的相互作用，从而导致光源频率发生变化，即光子的非弹性散射，又称为拉曼散射。若频率减小，称为斯托克斯散射；若频率增强，则称为反斯托克斯散射。拉曼光谱利用拉曼散射，获得拉曼光谱信号，对拉曼光谱进行分析，可得到分子振动、转动方面的信息。现在普及的商业化拉曼仪器主要是利用斯托克斯散射信号。反斯托克斯拉曼散射光谱（Coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy，CARS）也逐渐从实验室的开发应用发展为可普及的商业化设备。另外，拉曼信号主要来源于高度可极化的官能团，非对称的、具有高偶极矩的基团不能产生强的拉曼散射，大多数药物分子都具有可极化的官能团，有着很好的拉曼散射效应，因此，拉曼光谱技术在药物检测方面能够得到广泛的应用。拉曼光谱在药物检测方面的主要优势集中在：所需样品少（1~2 mg），最小程度处理样品，不仅适用于药物粉末，还适用于液体制剂和固体制剂的快速、无损性检测分析。通过拉曼光谱能够解决一些逆向工程分析中的疑难点比如药物活性成分（API）的晶型鉴定、原研制剂的成分确定，以及工艺参数的解析，如API 分布、包衣层厚度、包衣层数、生产工艺，以及与溶出特性有函数关联的空间分布等。

1  API 晶型分析

大多数情况下，原研药企业会使用API 最稳定的晶型以避免在生产储存过程中发生晶型转变。为保险起见，仿制药企业通常会选择与参比制剂（RLD）或原研制剂相同的API 晶型，以保证相似的稳定性和溶出特性。此外，如果原研药在化合物专利到期后，使用有效的药物晶型专利来延长保护期限，仿制药企业则必须使用另一种晶型来规避专利。因此，确定原研制剂中API 晶型是仿制药研发的关键步骤，这也是逆向工程中最重要的任务。晶型检测有着一系列可选择的分析方法，如X 射线粉末衍射、差示扫描量热、热重分析、振动光谱（远红外光谱，红外光谱及拉曼光谱），以及相对较新的方法，如太赫兹光谱（Terahertz spectroscopy）、CARS、同步辐射X 射线高分辨衍射（Synchroton XRPD）、核磁共振成像（NMR imaging）等。然而，对于制剂中无定形或低含量API 的晶型检测，可用的方法就相对较为局限。

1.1  制剂中无定形API 的检测

X 射线粉末衍射被认为是多晶型化学物质指纹性和专属性的首选表征手段。一般制剂中的API 晶型检测相对直接，但当API 为无定形时，X 射线粉末衍射检测失去作用，如下所述案例。已知某制剂中API 有2 种固态形式：无定形和半水合物。为确定2 个不同厂家生产的片剂（药片A、B）中API 晶型是否一致，首先需要应用X 射线粉末衍射对药片A、B 中API 晶型进行鉴定。对比药片A、B 与API 的X 射线粉末衍射图可见，药片A 的X 射线粉末衍射图谱与API 半水合物特征峰在整个图谱上都有很高的吻合度（见图1a 和 1d）。因为该API 只能以无定形和半水合物形式存在，因此可以基本肯定药片A 所含API 为半水合物。当比较药片B 的X 射线粉末衍射图谱（见图1b）与API 半水合物时，很难判断药片B中的API 是否也为半水合物。由于药片中同时含有晶体辅料（如乳糖）和其他无定形辅料，药片B 中API的晶型无法通过X 射线粉末衍射来确定。

应用拉曼光谱技术，比对图2 中药片A、B 与API 的拉曼光谱图。药片A 的拉曼图谱与API 半水合物的图谱基本一致（见图2a 和2d）。同时，药片B 的拉曼图谱与无定形API 的图谱基本一致（见图2b 和2c）。因此，在这种情况下，拉曼光谱可以很好地解决无定形API 在制剂中的鉴定问题。通常，不同固态形式API 的拉曼光谱间有一定差异。与结晶形API 相比，无定形API 的拉曼光谱表现为更宽的峰形，且有波数偏移。通过将实测样品的拉曼光谱与不同晶型API 的参考拉曼光谱进行比对，可鉴定制剂中API 的晶型。

值得一提的是，通常辅料拉曼信号很弱，低于API 信号，故拉曼技术用于不同厂家不同辅料的相同制剂时，可以在某些情况下完全排除辅料对API 的干扰。该特性极利于制剂中低含量API 的晶型检测，即使API 的含量较低，其在制剂中的信号仍然有可能被检测到，这对于制剂中API 的晶型鉴定尤为重要。

1.2  制剂中低含量API 的检测

某原研片中API 含量较低，仅为0.5%。文献报道，该API 有A、B、E 这3 种晶型，且晶型E 很难制备。比较原研片与文献中3 种晶型的X 射线粉末衍射图，未找到与3 种晶型相对应的衍射峰，再将原研片与片剂中主要辅料一水乳糖的X 射线粉末衍射图比较，发现其X射线粉末衍射图与一水乳糖几乎一致（见图3）；辅料一水乳糖严重干扰了制剂中API 的衍射信号。

注：a：药片A；b：药片B；c：无定形API；d：API 半水合物

图1 药片A、药片B、无定形API 和API 半水合物的X 射线粉末衍射

注：a：药片A；b：药片B；c：无定形API；d：API 半水合

图2 药片A、药片B、无定形API 和API 半水合物的拉曼光谱

注：a：原研片与一水乳糖的X射线衍射图；b：文献中API晶型A、B、E的X射线衍射图

图3 原研片与一水乳糖以及文献中API 晶型A、B、E 的X 射线衍射图

应用拉曼技术采集原研制剂的单点拉曼光谱，因单次采集样品信号面积小，可相对有效避开大量辅料的影响，采集到较强的API 信号。如图4 所示，若实验中使用的是反射模式，所采集到的样品信号主要来源于图中含有波浪线的矩形方框。将已采集到的原研制剂中的拉曼图谱与不同晶型的拉曼图谱相比较，即可鉴定制剂中的API 晶型。如图5 所示，该原研片采集到的单点拉曼光谱为较纯的API 光谱，不受一水乳糖的干扰，且晶型A、B 有不同的拉曼特征峰，比对原研片与晶型A、B 的拉曼光谱（见图6），可明显看出，原研片中的API 为晶型A。

图4 拉曼信号采集示意图

图5 原研片和一水乳糖的拉曼光谱

注：a：原研片拉曼光谱；b：文献中晶型A和B的拉曼光谱；A:晶型A;B：晶型B；C:含API的片剂；P:空白辅料

图6 原研片与文献中API 晶型A 和B 的拉曼光谱比较

2  组成成分分析

通常情况下，原研药公司会给出制剂组分列表，但对于未在列表中公布，含量极低的组分，如何准确判断其存在性则成为逆向工程分析的关键点。拉曼成像（Raman mapping）是基于通过自动移动显微镜载物台采集到大量在设定空间位置的拉曼光谱图的技术，将共聚焦显微技术与激光拉曼光谱技术结合。应用拉曼成像，即时的图谱结果可通过多种数学运算转换为样品组分图像（chemical image）。鉴定制剂中各成分最简单的方法是将在制剂上测得的所有拉曼图谱与每个单独组分的特征光谱相对比，如果某组分至少有一个不与其他组分重叠的特征峰能够被检测到，就能判断出该组分的存在。但这种情况在实际情况中很少出现。通常，制剂由不同化学类别的API 及辅料组成，并且，这些成分颗粒小，混合均匀；因此这种制剂的拉曼成像光谱有来自多种成分的信号重叠。如何高效准确地分析如此大量重叠、复杂的图谱便又成为另一个难点。

多变量分析方法，如主成分分析（PCA）是当前最主要的解决途径之一。PCA可用于分析复杂成像数据集，并提取有用的信息。以下实例将具体说明PCA 的应用。某制剂中可能含辅料X（未在制剂组分列表中），且含量极低。直接比对制剂拉曼成像光谱图与辅料X 的参比光谱（见图7），未找到辅料X 的信号。应用PCA 对拉曼成像数据集进行分析，生成该制剂组分的主成分载荷图（PC loadings，见图8）。将各主成分载荷图与各单独组分的参比光谱图进行对比，可确定各组分在该制剂中是否存在及大致的含量。将PC6 与辅料X的参比光谱进行比对，发现PC6 的载荷图与辅料X 的光谱图有大量吻合的波数段（见图9）。因此，PCA 的主成分载荷图分析提供了检测到低含量辅料X 的可靠依据。该制剂中各组分的分布如图10 所示。如果辅料X 均一地分布在制剂中，全面的拉曼成像结合多变量分析方法如直接经典最小二乘法（direct classical least squares，DCLS）还可估测辅料X 的含量。

图7 制剂及其各组分的拉曼光谱比较

图8 拉曼成像光谱的主成分载荷图

图9 PC6 载荷图与组分X光谱图的比较

图10 原研片拉曼成像分布图

3  固体制剂中成分分布

将拉曼显微光谱作为固体制剂无损分析手段应用于药学领域最早起源于20 世纪90 年代。与传统技术相比，拉曼显微光谱的最大优势在于它可以做到不破坏固体制剂的空间结构，“无损性”地分析其化学成分，还能通过对不同横截面的表征，分析不同规格、形状样品的内部信息，得到API 及辅料在制剂不同区域的分布。这种“无损性”分析看似没有明确的吸引力，但它所带来的“表面”分析信息有时可以起到其他技术所不能取代的功效，是常规的破坏性溶液分析技术如高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、分子排阻色谱所无法实现或替代的。对于多层次、包衣等复杂制剂，当API在不同厂家同一产品中的分布区域不同时，很可能说明不同厂家所采用的生产工艺不一样。而这种有差别的分布状态和制备工艺也可能直接暗示着不同厂家制剂在溶出时的行为差异。图11 为不同厂家的同一API 胶囊制剂，产品A 中API 主要集中在中间层（红色代表API，其他颜色代表辅料），而产品B 的API 主要混合在丸心。如果将这2 种产品作溶出对比，可以预见，溶出曲线将不会完全一致。反之，如果需要仿制产品A 或B，当清楚其API 及辅料的分布方式，产品的分层情况，可倒推制剂大致的生产工艺。那么，仿制工作将事半功倍，效率明显提高，工作量大大减少。

图11 不同厂家胶囊的拉曼成像分布图

4  结语

逆向工程作为解析原研制剂的一种有效方法，正日益受到仿制药研发人员的关注，在仿制药与原研药一致性评价中发挥着独特的优势。完整有效的逆向工程不仅能破解原研药的处方、工艺，还能辅助仿制药的优化开发。当然，拉曼光谱的应用绝不仅仅局限于这些方面。但鉴于拉曼测量及数据分析的相对复杂性，如何将拉曼光谱的分析方法及产生的数据集通过量子化学的基础理论有效应用于制药行业的逆向分析中还是当前亟需提高与普及的领域。此外，精准、高效的逆向工程分析还存在很多的技术挑战，有待于研发人员将各类固态及化学分析方法更灵活地配合使用。

【参考文献】

1. Fussell A, Garbacik E, Offerhaus H, et al. In situ dissolution analysisusing coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and hyperspectralCARS microscopy[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2013, 85(3):1141-1147.

   
   

2.Christophersen P C, Birch D, Saarinen J, et al. Investigation of proteindistribution in solid lipid particles and its impact on protein release usingcoherent anti-Stokes Raman scattering microscopy[J]. J ControlledRelease, 2015, 197: 111-120.

3.Jørgensen A C, Strachan C J, Pöllänen K H, et al. An insight into waterof crystallization during processing using vibrational spectroscopy[J]. JPharm Sci, 2009, 98(11): 3903-3932.

4.王玉, 李忠红, 张正行, 等. 拉曼光谱在药物分析中的应用[J]. 药学学报, 2004, 39(9): 764-768.

5.田芳, 王霆, 冯敏 等.拉曼技术在药物逆向工程中的应用[J]. 药学进展, 2016,40 (12):897-905.