D-氨基酸是许多生物活性分子重要的手性结构单元，广泛应用于制药、化妆品、食品和农用化学品行业中。目前，合成D-氨基酸的生物催化方法较多，其中，利用D-氨基酸脱氢酶对α-酮酸进行还原胺化的方法具有较高的原子经济性和理论产率。然而天然的D-氨基酸脱氢酶十分稀少，而且主要以膜蛋白的形式存在，难以实现工业化生产。

内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelatedehydrogenase,meso-DAPDH)是一种对α-酮酸的还原胺化反应具催化活性的D-氨基酸脱氢酶，具体反应路线如图1所示。

图1.meso-DAPDH催化α-酮酸的还原胺化反应

本文利用来自嗜热芽孢杆菌（Bacillusthermozeamaize）中的Ⅱ型内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶（BtDAPDH）作为模型，通过对其由内向外的分级改造，以提高酶催化α-酮酸不对称合成D-氨基酸的活性。

具体研究过程如下：

（1）BtDAPDH的分级改造及动力学特性研究

将底物和辅酶NADPH对接到BtDAPDH的活性中心，根据底物苯甲酰甲酸的羰基碳和底物结合口袋区域的氨基酸Cα之间的距离，可将BtDAPDH的分为3层，选择用于诱变的氨基酸残基（共43个残基）展示如图2。

图2.BtDAPDH不同层中选定突变的氨基酸

对第一、二层选择的位点分别用不同于该位点的其余19个氨基酸进行替换，并对好的单点突变体进行组合，从而获得较优突变体M4（W129T/D134C/F154V/H235I）；继续以M4为出发模板，对第三层的26个候选位点进行饱和突变，经过筛选获得最优的突变体M5（W129T/D134C/F154V/S177A/H235I）。M5的催化活性比野生型酶提高了275倍（如图3），对100mM底物的转化率高达86%，且M5的动力学参数kcat/Km是野生型酶的125倍，热稳定性也有所提高。

图3.BtDAPDH突变体相对于野生型

(WT)的突变位点及相对活性

（2）BtDAPDH野生型酶(WT)及其突变体M5的底物谱研究

本文探究了BtDAPDH野生型酶和最佳突变体M5的底物范围（如图4）。研究表明，突变体M5对芳香族和脂肪族的α-酮酸都具有优异的催化活性和立体选择性，ee值均能达到99%。

图4.BtDAPDH野生型酶(WT)及其突变体M5的底物谱

（3）突变体M5性能改变的机理研究

为了解释突变体M5催化活性和稳定性提高的机制，分别将底物苯甲酰甲酸对接到M5和NADPH、WT与NADPH的复合晶体结构中（如图5），再进行MD模拟。结果显示，与野生型相比，突变体M5在亚胺中间体形成中表现出更近的距离（d2:4.7Åvs10.0Å）和亲核攻击（d1:3.9Åvs8.9Å），这些都有利于催化效率的提升。

突变体M5中F154V和H235I的突变，导致非极性氨基酸残基的疏水侧链紧密相邻，形成疏水核心区域，促进底物的结合；且H162可以与底物形成π−π堆积相互作用，从而促进亚胺中间体的形成。这些构象调整有助于保持催化口袋的稳定性，防止结构冲突。

图5.底物苯甲酰甲酸分别与WT和NADPH（左）、M5和NADPH（右）的复合晶体结构

（4）突变体M5的反应条件优化

本文作者以苯甲酰甲酸为底物，对反应温度、pH、胺浓度、NADP+浓度等影响因素进行优化。由于甲酸脱氢酶(BstFDH)与DAPDH酶的偶联可有助于反应中NADPH辅因子的再生，会影响反应。因此，本文同时也对M5与BstFDH的投料比例进行了优化。

在5mL体系中，采用补料分批方式，最佳反应条件为：温度30℃，pH10，1M甲酸胺，0.2mM的NADP+，M5和BstFDH的比例为1:12，反应24h后转化率高达99.5%。

（5）突变体M5的应用

本文将得到的BtDAPDH最佳突变体M5应用于合成左旋苯甘氨酸、苯丙氨酸和D-苯基丁氨酸（克级规模），产率均大于80%，ee值均大于99%（如图6）。

图6.利用BtDAPDH突变体M的应用案例

本文总结：本文通过对酶进行分级工程改造，扩大了底物与酶的结合口袋，最终获得了具有高催化活性的最佳突变体BtDAPDH-M5。M5同时还具有良好的热稳定性和立体选择性，可有效催化大体积脂肪族和芳香族类的α-酮酸进行的不对称还原胺化反应。

文章来源：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c03164?fig=tgr1&ref=pdf.

责任编辑：青霉素

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