1. 简介

自 2001年第一次概念验证以来，小分子诱导的靶向蛋白质降解逐渐成为药物研发的一个热门方向。用于诱导降解的策略主要有两种，一是使用可以改变E3连接酶底物识别域的小分子，即所谓的分子胶，从而允许募集新底物进行蛋白水解； 二是使用嵌合小分子，该小分子由与结合所需靶蛋白的模块连接的E3连接酶结合部分组成。本文将主要讨论后者。

靶向嵌合体（PROTAC，也称为 SNIPER、uSMITE 或降解剂）和双功能小分子降解剂由于其催化活性（效力）、通过蛋白间相互作用诱导同工酶选择性的能力以及偏离“五规则”而广为人知。PROTAC能够同时结合E3连接酶的底物识别域和感兴趣的蛋白质(POI)，从而诱导非同源泛素化和随后的POI降解。目前有六种独特的嵌合降解剂分子在人体中的效用正在通过临床试验中进行研究。PROTACs的独特代谢活性来自于它们能够从泛素-蛋白酶体系统 (UPS) 中适当地使用RING泛素连接酶，该系统通过用多聚泛素链标记蛋白质来调节蛋白质稳态，从而标记它们进行蛋白水解。 

PROTAC的效力和同工酶选择性可以通过连接基团（Linker）内的构-效关系 (SAR) 进行优化。连接部分的长度和化学成分已被证明会影响 PROTAC的结构刚性、疏水性和溶解性等。目前，关于连接部分的长度部分的SAR研究主要还是经验性的，是一项时间和劳动密集型的工作。虽然通过结构生物学和计算研究在合理的PROTAC设计方面取得了很大进展，但连接基团的设计、合成依然是一项繁重的工作。Michael D. Burkart等最近发表在Journal of Medicinal Chemistry的观点文章，阐述了接头设计在靶向嵌合体的蛋白水解中的作用。

（来源：参考文献）

2. PROTAC中连接基团的优化

2.1 提高合成通量的方法

当前简化接头变体SAR研究的方法包括：通过使用正交保护的双功能接头固相合成、铜催化点击化学、活化酯、和Staudinger连接化学来提高合成通量（图1）。有许多策略已被证明可以实现基于免疫调节酰亚胺药物（CRBN 招募）系统的 PROTAC接头变体套件的模块化合成，但到目前为止它们似乎都没有在该领域得到广泛应用。尽管所提出的大多数策略都可以转化为VHL（Von Hippel−Lindau）或其他E3连接酶招募系统，但只有铜催化的点击平台特别证明了这一点，然而将三唑部分引入接头可能不会产生理想的物理化学由于其高拓扑总极性表面积。所有这些策略都将从功能化（炔烃、Boc 保护的胺末端或叠氮化物末端）连接的E3连接酶配体库的可用性中受益匪浅。实际上，许多合成模块可以购买到。

图1. 已发表的用于合成PROTAC的合成方法。（来源：参考文献）

2.2 合理的PROTAC连接基团的设计

2.2.1 利用X-ray晶体学数据和计算模型合理设计PROTAC

Gadd等人解决了三元复合物中降解剂（MZ1）的第一个 X 射线结构，使用这些数据，他们能够合理地设计出更具选择性的溴结构域降解剂（AT1）。Farnaby及其同事能够从SMARCA2:PROTAC 1:VHL (PDB 6HAY)的共晶结构中识别 PROTAC 1的PEG接头和VHL之间关键的稳定相互作用。基于这些数据，他们在不牺牲产生ACBI1的关键PEG相互作用的情况下，通过在接头区域插入苯基部分引入了额外的T形堆积相互作用并增加了刚性（图2a）；一种改进的SMARCA2/4降解剂。

Nowak等通过使用一组X射线结构进行RosettaDock模拟，基于已知的泛溴域降解剂dBET6（图2b）开发了一种新型BRD4选择性降解剂ZXH-3-26相关的、PROTAC结合的三元复合物。结构预测还表明，PROTAC接头长度的最小化将通过减少POI-PROTAC-连接酶三元复合物的有利结合模式的数量来提高降解剂的选择性。

Testa等使用 BRD4BD2和VHL与已知溴结构域降解剂 MZ1 (PDB 5T35) 结合的复合物的分子动力学模拟，确定了一种有效的异构体选择性（BRD4BD2选择性）溴结构域降解剂（图2c）。

图2. 合理设计PROTAC（来源：参考文献）

2.2.2 PROTAC设计软件开发

为了使用分子操作环境 (MOE) 和开源Rosetta软件套件合理设计从头 PROTAC开发，更严格的计算方法已经被开发出来了（图3）。这些方法不仅成功地在计算机上重现了从X射线晶体学中确定的PROTAC结合模式，而且还与基于先前生物学评估的效力和选择性趋势一致。

Drummond等使用MOE软件套件开发了一系列用于生成和分析PROTAC三元复合物的协议（图3a）。在这些协议中，最有效的方法是在没有POI和连接酶的情况下对降解剂的构象空间进行采样，以识别在后续步骤中将进行对接模拟的降解剂构象。

Zaidman等人使用开源Rosetta软件套件来开发PROsettaC（图3b）。就此而言，PROsettaC与Drummond等开发的相似，因为两个配体与其各自目标的二元复合物的结构是必要的输入。

Bai等人描述了另一种基于Rosetta的协议（图3c）。该协议仍然依赖配体结合的二元 X 射线晶体结构作为初始输入，但是它使用了最初为抗体-抗原对接开发的全局对接协议来生成不同姿势的POI 和关于固定的配体位置的连接酶的初始集合。

总体而言，这些研究表明PROTAC开发受益于计算机辅助优化。计算机中PROTAC开发的目标旨在通过最大限度地减少合成和生物评估分子的数量来提高通量，以便令人满意地降解目标蛋白质。

图3. PROTAC计算方法开发的最新进展（来源：参考文献）

2.3 连接基团的经验SAR

通过对文献报道的连接基团长度与降解效率之间的关系进行统计分析，作为测试 E3连接酶和POI之间兼容性的一种手段，可能最好以较长的接头长度开始经验性接头长度 SAR 研究。然而，数据并不一定表明任何大于最佳长度的接头都会产生成功的降解剂；只是一般来说，由于没有空间冲突，较长的连接子会增加找到降解剂的机会。

3. 总结

PROTAC开发活动的经验性质正在被嵌合小分子合成方法、三元复合物的结构表征、计算协议的进步以及对先前研究的系统分析的均衡发展所逐渐替代。PROTAC开发为药物设计提供了一个戏剧性的弯路，因为重点已经转移到能够稳定非同源蛋白质相互作用足够长的小分子以进行多泛素化。这种事件驱动的药理学使得重新利用因缺乏效力或缺乏选择性而被搁置的先前废弃的配体成为可能。它还提供了一种有效靶向非催化蛋白质靶标的方法，显著扩展了潜在的先导化合物。通过本文所描述的专业领域之间的持续合作，期望能够通过开发处能够替代连接基团经验性质的方案来减少PROTAC的开发时间。

参考文献：

Troy A. Bemis, James J. La Clair, and Michael D. Burkart* Unraveling the Role of Linker Design in Proteolysis Targeting Chimeras. J. Med. Chem. 2021.

责任编辑：琉璃

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